Efeito de ExoU na ativação de NF-κB e na secreção de IL-8 por células humanas infectadas por Pseudomonas aeruginosa

ExoU, uma citotoxina produzida pelo patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa e translocada para o citossol de células hospedeiras via sistema de secreção do tipo III, é associada à gravidade de infecções agudas. Estudos anteriores realizados em nosso laboratório relataram a potente atividade pró-inflamatória de ExoU, responsável por um intenso recrutamento de neutrófilos para o sítio de infecção. No presente trabalho, o efeito de ExoU na modulação da ativação do fator transcricional NF-κB e na regulação da expressão e da secreção da quimiocina para neutrófilos IL-8 foi avaliado em culturas de células epiteliais respiratórias e endoteliais humanas infectadas com a cepa PA103 de P. aeruginosa (produtora de ExoU) ou com a mutante deletada no gene exoU, PA103κexoU. Análises por RT-PCR semi-quantitativo mostraram que a infecção pela cepa produtora de ExoU levou ao aumento dos níveis de mRNA de IL-8, enquanto ensaios de alteração da mobilidade eletroforética (EMSA), supershift e com gene repórter mostraram que ExoU induziu a translocação nuclear do heterodímero transativador p65/p50 de NF-κB e a ativação da transcrição de genes dependente deste fator transcricional. Adicionalmente, o tratamento das culturas celulares com um inibidor de NF-κB antes da infecção bacteriana reduziu significativamente os níveis de mRNA de IL-8 e da secreção desta quimiocina. Em conjunto, estes resultados mostram que ExoU ativa NF-κB e, consequentemente, estimula a expressão e a secreção de IL-8 por células epiteliais respiratórias e células endoteliais infectadas com P. aeruginosa

Efeitos do extrato de Chenopodium ambrosioides L. na cistite induzida pela ciclofosfamida

A cistite hemorrágica (CH) consiste em um processo inflamatório difuso de origem infecciosa ou não que resulta em um sangramento da mucosa vesical. As CH crônicas recorrentes induzidas pela ciclofosfamida (CYP) são um desafio na prática clínica pela alta morbidade e por vezes mortalidade dos pacientes. O tratamento da CH induzida pela ciclofosfamida consiste no uso de MESNA, disulfiram, N-acetil-cisteína, anti-inflamatório, oxigênio hiperbárico, hiper-hidratação e irrigação vesical, mas novas terapias têm sido investigadas, inclusive usando produtos naturais. A espécie vegetal Chenopodium ambrosioides L., conhecida popularmente como mastruz, mastruço e erva-de-Santa-Maria, tem sido relatada pela população como anti-inflamatório e analgésico. O presente estudo investigou os efeitos do extrato bruto hidroalcoólico de folhas de Chenopodium ambrosioides na CH induzida pela ciclofosfamida em ratos. Vinte e nove ratos receberam 150 mg/kg de CYP por via intraperitoneal (i.p.) para indução de CH e em seguida foram divididos em três grupos: controle negativo (CN), tratados com soro fisiológico a 0,9%; extrato bruto hidroalcoólico de Chenopodium ambrosioides (EBHCa), tratado com dose única de 50 mg/kg de extrato bruto hidroalcoólico de Chenopodium ambrosioides (EBH) e controle positivo (CP), tratados com dose única de 15 mg/kg de diclofenaco de potássio, todos por gavagem. Após 48 horas da indução da CH os animais foram sacrificados para retirada da bexiga, que foi preparada para análise histopatológica e imuno-histoquímica. O EBH foi capaz de diminuir o peso da bexiga e histologicamente a inflamação aguda e crônica da bexiga, a extensão do infiltrado inflamatório na parede vesical e a neoformação capilar do mesmo modo que o diclofenaco de potássio, quando comparados ao grupo CN. Observou-se ainda uma redução da expressão imuno-histoquímica de cicloxigenase-2 (COX-2) e do fator nuclear kappa B (NFB) na bexiga. No presente estudo o EBH das folhas de Chenopodium ambrosioides apresentou atividade anti-inflamatória, semelhante ao diclofenaco de potássio, no tratamento da CH induzida pela CYP.

Óleo de peixe (fonte de ácidos graxos n-3) atenua inflamação das vias aéreas e hiper-reatividade pulmonar induzida por alérgeno em camundongos

O óleo de peixe é rico em ácidos graxos poli-insaturados (AGPI) n-3 e vem sendo apontado como anti-inflamatório associado à melhora de diversas doenças de natureza inflamatória. No presente estudo, objetivou-se avaliar a influência do óleo de peixe sobre a inflamação pulmonar e hiper-reatividade em camundongos ativamente sensibilizados desafiados com ovoalbumina (OVA). Camundongos A/J machos foram alimentados com dieta standard-chow (SC) ou dieta rica em óleo de peixe (Px) durante 8 semanas. Após 4 semanas do início da dieta, cada grupo foi subdividido aleatoriamente para ser desafiado com salina (SC-SAL e PX-SAL) ou ovoalbumina (SC-OVA e PX-OVA). A função pulmonar (resistência e elastância) foi avaliada através de pletismografia invasiva, na condição de aerolização ou não com metacolina 24 horas após o último desafio antigênico. Foi realizado lavado broncoalveolar (LBA) para contagem de leucócitos e quantificação de eotaxina-2. A deposição de muco e de matriz peribronquiolar e o infiltrado de eosinófilos foram quantificados no tecido pulmonar. Foram avaliados interleucina (IL)-13 através de imunohistoquímica e NFκB, GATA-3 e PPARγ, por western-blotting. O desafio com OVA resultou em aumento da infiltração de eosinófilos, elevada produção de citocinas inflamatórias, remodelamento pulmonar, produção de muco e hiper-reatividade das vias aéreas. Detectou-se aumento na expressão dos fatores de transcrição NFκB e GATA-3 nos camundongos do grupo sensibilizado e desafiado com OVA em comparação aos controles. Todas essas alterações foram atenuadas nos camundongos que receberam dieta com óleo de peixe. Expressão elevada de PPARγ foi detectada nos pulmões dos camundongos dos grupos alimentados com óleo de peixe. Em conclusão, nossos resultados mostram que a ingestão de óleo de peixe atenuou as características clássicas do quadro asmático através da modulação da síntese de mediadores inflamatórios, via regulação negativa de NFκB e GATA-3 e regulação positiva de PPARγ. O óleo de peixe parece ser uma terapia alternativa para o controle e tratamento da asma.

Efeito da restrição protéica materna durante a lactação sobre a resposta de timócitos da prole jovem de ratos Wistar

Neste estudo investigamos as consequências da restrição protéica materna durante a lactação sobre a resposta de timócitos da prole jovem de ratos Wistar (grupo D), identificando o papel da leptina nas alterações encontradas. Observamos que, quando comparados ao grupo controle, os animais do grupo D apresentaram, aos 30 dias de vida, uma diminuição significativa tanto do peso corporal quanto do timo. Contudo, não observamos alterações no número de timócitos, no perfil de células CD4/CD8 ou na resposta proliferativa destas células. Sistemicamente, o grupo D não apresentou alterações nos níveis séricos de corticosterona ou no conteúdo nuclear do seu receptor (GR) em timócitos. Apesar dos animais D não apresentarem alterações nos níveis circulantes de leptina, a expressão do seu receptor, ObRb, estava aumentada nos timócitos. Esta alteração foi acompanhada pela amplificação da resposta de sinalização da leptina nestas células, observada por um aumento na ativação de JAK2 e STAT3 após a incubação com leptina. Os timócitos isolados do grupo D apresentaram uma diminuição significativa na taxa de apoptose espontânea quando comparados ao grupo controle. Corroborando estes resultados, demonstramos que os timócitos dos animais D apresentam um aumento na expressão da proteína antiapoptótica Bcl-2 e uma redução da expressão da proteína próapoptótica Bax, além de um maior conteúdo de Pró-caspase-3, entretanto, não encontramos alterações no conteúdo de Bad. Além disso, timócitos do grupo D apresentaram um maior conteúdo da subunidade p65 do NFĸB no núcleo, associado a uma menor expressão de IĸBα no citoplasma. Finalmente, observamos um aumento na expressão do RNAm para o gene ob (leptina) mas não para o gene db (receptor) no microambiente tímico dos animais D. Em conjunto, nossos dados mostram que a restrição protéica durante a lactação afeta a homeostase tímica, induzindo uma maior atividade de leptina, que protege os timócitos da apoptose na prole jovem, sugerindo que esses animais poderiam ser mais suscetíveis a alterações na resposta imune na vida aduta.

Participação do estresse oxidativo na lesão pulmonar induzida por lipopolissacarídeo: repercussões inflamatórias estruturais e funcionais

O objetivo do presente estudo foi investigar o envolvimento do estresse oxidativo na lesão pulmonar aguda (LPA) induzida por lipopolissacarídeo (LPS) e as repercussões inflamatórias, estruturais e funcionais, através de análises bioquímicas de estresse oxidativo, prova de função pulmonar, análise histológica e RT-PCR para citocinas e fatores de transcrição pró-inflamatórios. Na primeira etapa foram utilizados camundongos machos C57BL6 foram divididos em sete grupos: Grupo controle (CTR) (50 μL de solução fisiológica) administrados via intratraqueal [it], LPS 6 horas (10 μL de LPS) [it], LPS 12 horas (10 μL de LPS) [it], LPS 24 horas (10 μL de LPS) [i], LPS 48 horas (10 μL de LPS). Para verificar que as alterações observadas eram estresse oxidativo dependentes camundongos machos C57BL6 foram pré-tratados com N-acetilcisteína (NAC) 1 hora antes do estímulo com LPS e sacrifícados 24 horas depois do estímulo com LPS. Os animais foram divididos da seguinte forma: Grupo LPS 24 horas (10 μL) [it], grupo NAC 40 mg/kg (gavagem) + LPS (10 μL) [it] e grupo NAC 100 mg/kg (gavagem) + LPS (10 μL) [it]. O sistema antioxidante enzimático protegeu o pulmão do estresse oxidativo nas primeiras 12 horas. O estresse oxidativo foi caracterizado em 24 horas e em 48 horas observou-se falência do sistema antioxidante enzimático. Parâmetros de função pulmonar se mostraram alterados nos grupo estimulados com LPS principalmente no grupo LPS. A elastância (p<0,001), resistência de via aérea periférica (ΔP2) (p<0,001), resistência de via aérea central (ΔP1) (p<0,001) e resistência de via aérea total (ΔPtot) (p<0,001) se mostraram principlamente alteradas no grupo LPS 24 horas. O pré-tratamento com NAC impediu o aumento dos parâmetros de elastância (p<0,001), resistência de via aérea periférica (ΔP2) (p<0,001) resistência de via aérea central (ΔP1) (p<0,05) e resistência de via aérea total (ΔPtot) (p<0,001) comparado com o grupo LPS 24 horas. As alterações histológicas como espessamento de septo alveolar, influxo de células inflamatórias e hemorragia mostraram-se tempo dependentes. O pré-tratamento NAC impediu as alterações observadas nos grupo estimulados com LPS. Alterações inflamatórias foram observadas no grupo estimulado com LPS como IL-6 (p<0,001), iNOS (p<0,001), COX2 (p<0,05), TNF-α (p<0,001) e NFκB (p<0,001) quando comparados ao grupo controle. O pré-tratamento com NAC impediu o aumento desses parâmetros como IL-6 (p<0,001), iNOS (p<0,001), COX2 (p<0,05), TNF-α (p<0,05) e NFκB (p<0,001) quando comparados ao grupo LPS 24 horas. Nossos resultados sugerem que o estresse oxidativo desempenha um papel importante nas respostas inflamatórios, estruturais e funcionais no modelo de LPA induzido por LPS e que essas alterações são estresse oxidativo dependentes.

Modulação redox da homeostase de células musculares lisas através de estimuladores do sistema NADPH oxidase

As doenças cardiovasculares representam a principal causa de morte nos países ocidentais. Dentre essas doenças, a aterosclerose é que mais se destaca, sendo caracterizada pelo acúmulo de células musculares lisas vasculares (CMLV). O efeito patológico das CMLV em resposta a diferentes estímulos pode acarretar em disfunções nestas células. É notável que a aterosclerose ocorra principalmente em vasos sinuosos onde ocorre um forte turbilhonamento do fluxo sanguíneo, que pode acarretar em hemólise e, consequentemente, acúmulo de heme livre. Além disso, no processo de aterogênese as moléculas de adesão, principalmente integrinas, são de crucial importância durante a resposta de CMLV. Nesse trabalho nosso objetivo inicial foi avaliar o efeito do heme livre nas funções de CMLV, bem como os mecanismos moleculares por trás desses efeitos. Em uma segunda parte, investigamos o envolvimento da integrina α1ß1 no efeito da Angiotensina II (Ang II) em CMLV. Nós observamos que o heme livre é capaz de induzir a proliferação e migração de CMLV via espécies reativas de oxigênio (ERO) provenientes da NADPHoxidase (NADPHox). Adicionalmente vimos que o heme ativa vias de sinalização redox-sensíveis relacionadas à proliferação celular, como MAPKinases e o fator de transcrição NFκB. Também observamos que há uma ligação entre a NADPHox e o sistema heme oxigenase (HO), uma vez que o heme induz a expressão de HO-1 e o pré-tratamento das CMLV com inibidores de HO levam ao aumento tanto o efeito proliferação quanto a indução de ERO promovidas pelo heme. Além disso, vimos que o efeito contra-regulatório promovido pela HO ocorre devido as metabolites do heme: biliverdina, bilirrubina e monóxido de carbono. Por último, quando bloqueamos tanto a NADPHox quanto o sistema HO o heme não teve efeito algum na proliferação de CMLV. Em um segundo estudo, observamos que o efeito da Ang II sobre a migração de CMLV foi inibido quando as células foram pré-tratadas com o ligante da integrina α1ß1, a desintegrina Obtustatina. A seguir observamos que o efeito da Ang II na ativação de FAK e na colocalização actina-ILK é dependente da integrina α1ß1, que possivelmente ativa PKCα, uma vez que vimos que a produção de ERO induzida por Ang II foi inibida pela Obtustatina. Vimos que a indução da expressão de ILK por Ang II em CMLV é dependente da integrina α1ß1 e também observamos que a Obtustatina inibibiu o desacoplamento de ILK da FAK, uma vez que a Obtustatina bloqueou a fosforilação de FAK induzida por Ang II (processo crucial para o desacoplamento da ILK). Nós também observamos que a Ang II induz, via integrina α1ß1, a fosforilação de AKT e a diminuição da expressão de p21, provavelmente via ILK. Corroborando estes dados, nós mostramos que o pré-tratamento com Obtustatina induziu um estacionamento na fase G0 e diminuição da proliferação de CMLV tratadas com Ang II. Portanto, mostramos nesse trabalho que o heme livre induz a ativação de CML via NADPHox, que é elegantemente contra-regulado pelo sistema HO. Além disso, sugerimos que a integrina α1ß1 pode ser um importante alvo molecular para o desenvolvimento de intervenções mais efetivas para a aterosclerose.

Avaliação do efeito anti-inflamatório e antiasmático da 15-deoxy-delta-12,14-prostaglandina J2 em modelos murinos de asma

A asma é um distúrbio crônico pulmonar caracterizado por inflamação, obstrução e remodelamento brônquico, levando a sintomas como sibilo, tosse e falta de ar. A terapia antiasmática consiste em corticosteroides inalados e agonistas β2 de curta ou longa duração. O tratamento é limitado por efeitos colaterais e refratariedade de alguns pacientes, justificando a necessidade de novas terapias. Estudos demonstram que a 15-deoxy-delta- 12,14-prostaglandina J2 (15d-PGJ2), um ligante endógeno de receptores ativados por proliferadores de peroxissomos do tipo gama (PPAR-γ), é capaz de reduzir a expressão de citocinas pró-inflamatórias, o que pode resultar em benefícios no tratamento de doenças com esse perfil. O objetivo deste estudo foi avaliar o potencial anti-inflamatório e antiasmático da 15d-PGJ2 em modelos experimentais de asma. Camundongos A/J machos foram sensibilizados nos dias 0 e 7 através de injeção subcutânea (s.c.), contendo ovoalbumina (OVA) e Al(OH)3, e desafiados com 4 instilações intranasais (i.n.) de OVA em intervalos semanais. O tratamento com 15d-PGJ2 (30 e 100 g/Kg, s.c.) foi realizado 30 min antes dos desafios a partir da terceira provocação antigênica. Em outro modelo, camundongos A/J foram desafiados intranasalmente com extrato de ácaro 3 vezes por semana durante 3 semanas. As administrações de 15d-PGJ2 (30, 70 e 100 g/Kg, s.c. e 0,65; 1,5 e 2,3 g/animal, i.n.) foram realizadas a partir da 3 semana, 30 min antes dos desafios. As análises ocorreram 24 h após o último desafio. Nossos resultados mostraram que, em camundongos previamente sensibilizados e desafiados com OVA, a administração de 15d-PGJ2 limitou significativamente o influxo peribrônquico de eosinófilos e neutrófilos, bem como a produção de muco por células caliciformes e fibrose sub-epitelial, além da hiperreatividade das vias aéreas e produção de IL-5. A redução do epitélio brônquico e das citocinas IL-13 e TNF-α foram observadas somente na maior dose administrada. No modelo HDM a inflamação e o remodelamento foram atenuados em todas as doses administradas do composto, enquanto que a hiperresponssividade brônquica foi inibida apenas nas doses de 70 e 100 μg/Kg (via sistêmica) e na dose intermediária dada topicamente (1,5 μg/animal, i.n.). Os níveis de citocinas foram atenuados pelo tratamento subcutâneo, porém somente os níveis de IL-17, eotaxina-1 e TNF-α foram inibidos com a dose intranasal de 0,65 g/animal. O aumento da expressão de NF-κB, induzido por provocação com HDM também foi reduzido significativamente pela administração de 15d-PGJ2. Em conjunto, nossos dados indicam que o tratamento com 15d-PGJ2 inibe alterações cruciais associadas à patogênese da asma, em modelos experimentais distintos da doença, demonstrando possuir grande potencial para controlar e reverter inflamação, hiperreatividade e remodelamento pulmonar desencadeados por provocação alérgica.

Ação molecular da 1,25(OH)2D3 em células endoteliais humanas submetidas a diferentes concentrações de leptina

Altas concentrações plasmáticas de leptina têm sido relacionadas ao aumento da formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) que podem desempenhar um papel regulador central em eventos inflamatórios e cardiovasculares. Estudos recentes têm demonstrado que a vitamina D é capaz de reduzir marcadores do estresse oxidativo, bem como modular a produção de citocinas inflamatórias. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito do pré-tratamento com concentração fisiológica (10-10 M) e suprafisiológica(10-7 M) de 1,25(OH)2D3 na produção do ânion superóxido (O2) e nos fatores de transcrição NF-κB e Nrf2,em células endoteliais humanas estimuladas com diferentes concentrações de leptina (1 e 10 ng/mL). Quando as células foram pré-tratadas com 1,25(OH)2D3, e estimuladas com leptina (1 e 10 ng/mL), a 1,25(OH)2D3 reduziu (p<0,05) a produção de ânion superóxido (O ), principalmente na concentração de 10-7 M. O fator de transcrição NF-κB foi positivamente ativado em células incubadas com 10 ng/mL de leptina, entretanto, quando se realizou o pré-tratamento com 1,25(OH)2D3 houve redução da translocação do NF-κB, assim como a produção de citocinas reguladas por este fator de transcrição. Também foi observado que o pré-tratamento com 10-7 M de 1,25(OH)2D3 aumentou de forma significativa (p<0,05) a expressão do fator de transcrição Nrf2 na fração nuclear em comparação ao controle, principalmente quando associada à 10 ng/mL de leptina (p<0,05). Tomados em conjunto, nossos resultados indicam que o tratamento com ambas as concentrações, 10-10 e 10-7 M de 1,25(OH)2D3 em células endoteliais humanas, foram eficazes em inibir a produção do ânion superóxido (O2), citocinas pró-inflamatórias, bem como inibir a translocação nuclear do fator de transcrição NF-κB, e ativar a via antioxidante Nrf2. Estes achados sugerem que o pré-tratamento com ambas as concentrações (fisiológica e suprafisiológica) de 1,25(OH)2D3 na presença de alta concentração de leptina, pode ter um efeito positivo no endotélio através da regulação de marcadores de inflamação e atividade antioxidante